型號(hào)： AZ00008
儲(chǔ)運(yùn)條件
-20℃
產(chǎn)品組成
產(chǎn)品簡介
基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依據(jù)DNA 片段與線性化載體末端的15~25 nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景低，是一種簡單、快速的DNA 定向克隆技術(shù)。
Fast One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒，一次反應(yīng)可完成單至多個(gè)DNA 片段的重組，快僅需5 分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于95%。Kit 中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率；經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠一定程度上耐受未純化PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 實(shí)驗(yàn)流程概要
2. 線性化克隆載體制備
選擇合適的克隆位點(diǎn)，對(duì)載體進(jìn)行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向PCR 擴(kuò)增完成。
① 酶切制備
一些限制性內(nèi)切酶不能有效地消化超螺旋DNA，因此可能會(huì)留下不同數(shù)量的未切割載體DNA，降低陽性率。推薦使用LightNingTM 快速內(nèi)切酶進(jìn)行酶切（單酶切或者雙酶切），使載體線性化wanquan，以降低轉(zhuǎn)化背景（未切割的載體轉(zhuǎn)化獲得的假陽性克隆）。
注1：經(jīng)酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化，推薦使用雙酶切。
注2：酶切完成后，建議將內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后用于重組反應(yīng)。
② 反向PCR 擴(kuò)增制備
為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對(duì)克隆陽性率的影響。
注1：PCR 產(chǎn)物無非特異性條帶時(shí)， 推薦使用Template Eliminator（ 貨號(hào)：EG21203）消化質(zhì)粒模板即可用于重組反應(yīng)；反之建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用。
注2：多片段克隆時(shí)，建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用。
3. 插入片段PCR 引物設(shè)計(jì)
PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18 nt）序列。假如載體為粘性末端，且3' 端突出，則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分；若5' 端突出，則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分，也可以不包含。
插入片段正向擴(kuò)增引物：
5'—上游載體末端同源序列+ 酶切位點(diǎn)（可選）+ 基因特異性正向擴(kuò)增序列— 3'
插入片段反向擴(kuò)增引物：
3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+ 酶切位點(diǎn)（可選）+ 下游載體末端同源序列—5'
注1：盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆，當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為40%~60% 時(shí)，重組效率高；
注2：本試劑盒所提供的pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：
4. 插入片段的PCR 擴(kuò)增
推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng)，若PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%。
5. 重組反應(yīng)
① 于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：
a. 適載體用量(ng) = 0.02 × 載體堿基對(duì)數(shù)，即0.03 pmol。
b. 插入單片段，適片段用量（ng）= 0.04 × 片段堿基對(duì)數(shù)；插入多片段，每片段適用量（ng）= 0.02 × 片段堿基對(duì)數(shù)。
注1：若插入單片段的長度大于載體，則應(yīng)互換載體與插入片段用量；
注2：若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段應(yīng)使用5 倍載體用量；
注3：若按上述公式計(jì)算得到的用量超過低/ 高值，則建議直接按低/ 高用量使用；
注4：載體片段過長、插入片段過長或片段數(shù)過多，克隆陽性率均會(huì)降低。
重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋。
② 將反應(yīng)體系置于50℃，反應(yīng)5~60 min。
注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較jingzhun的儀器進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間不足或太長克隆效率均會(huì)降低；
注2：插入1~2 個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間為5~15 min；插入3~5 個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間為15~30 min；
注3：當(dāng)載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時(shí)，建議延長反應(yīng)時(shí)間到30~60 min；
注4：50℃反應(yīng)完成后，建議進(jìn)行瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液收集至管底。
③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲(chǔ)存于 -20℃。
注 1： -20℃儲(chǔ)存的重組產(chǎn)物，建議在 1 周內(nèi)使用。
6. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
取5~10 μl 反應(yīng)液，加入到100 μl 感受態(tài)細(xì)胞中，緩慢吸打混勻，冰上放置30 min。42℃ 熱激45~60 sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或 LB 培養(yǎng)基，37℃ 振蕩培養(yǎng)40~60 min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素的平板上，倒置于37℃ 過夜培養(yǎng)。
注1：不同感受態(tài)細(xì)胞后的克隆陽性率會(huì)有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率 > 108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞；
注2：菌落數(shù)取決于PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；
注3：陽性對(duì)照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對(duì)照平板只生長很少的菌落。
7. 陽性克隆檢測
挑取單菌落至10 μl ddH2O 中混勻，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作為模板，進(jìn)行菌落PCR 鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
陽性對(duì)照的陽性克隆檢測，菌落PCR 引物使用通用引物M13F 與M13R，酶切鑒定用HindIII 與EcoRI。
注1：菌落PCR 時(shí)建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結(jié)果；
注2：必要時(shí)可進(jìn)一步對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行測序鑒定。
注3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGAC
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