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轉染原代BMDM細胞技術分享

影響影子：IF:12.40
發表期刊:Theranostics
Doi: 10.7150/thno.66420

原文標題：5-aza-2′-deoxycytidine potentiates anti-tumor immunity in colorectal peritoneal metastasis by modulating ABC A9-mediated cholesterol accumulation in macrophages。
背景：5-aza-2'-脫氧胞丁胺（5AZA），是一種DNA甲基轉移酶（DNMT）抑制劑，可激活腫瘤適應性免疫，抑制腫瘤進展。然而，5Aza調節腫瘤免疫微環境的分子機制仍不清楚。
方法：研究了5AZA在結直腸癌（CRC）的腹膜癌（PC）免疫微環境中的作用。 通過流式細胞儀，實時PCR，Western印跡測定法和藥物親和力響應靶標穩定性（DARTS）研究了5AZA對巨噬細胞激活的影響。 5AZA對CRC患者的基質巨噬細胞和T細胞中驗證了5AZA對腫瘤免疫力的影響。
結果：5Aza可以刺激巨噬細胞向M1樣表型的激活，并隨后刺激轉移前脂肪組織中T細胞的激活，最終抑制免疫功能小鼠模型中的CRC-PC。從機制上講，5Aza刺激原代小鼠巨噬細胞向M1樣表型發展，其特征是p65磷酸化和IL-6表達增加。此外，我們篩選并鑒定了ATP結合盒轉運蛋白A9（ABC A9）作為5Aza的結合靶標。5Aza以ABC A9依賴的方式誘導膽固醇積累、p65磷酸化和IL-6表達。NF-κB的藥理學抑制或IL-6的遺傳耗竭消除了5Aza在小鼠中的抗腫瘤作用。此外，常規化療藥物5-Fu或OXP協同增強了5Aza的抗腫瘤作用。最后，我們驗證了5Aza在CRC患者基質巨噬細胞和T細胞抗腫瘤免疫中的重編程作用。

結論：綜上所述，我們的發現表明5AZA通過調節巨噬細胞依賴性的T細胞激活前分散微環境中抑制了CRC-PC，同時抑制了CRC-PC。發現了5AZA在調節ABC A9相關的膽固醇代謝和巨噬細胞激活方面的DNA甲基化獨立機制。
文章引用：

Small interfering RNA (siRNA)-mediated gene silencing

We used transfection reagent (#AD600150, ZETA life, USA) to transfect specific siRNA of ABC A9 into cells to silence their expression according to the manufacturer’s protocol. Briefly, macrophages were placed in a 6-well plate with a density of 2.5 × 105 cells. Transfection was performed when the cell density was 70%. 10 µL of siRNA (100 pmol/mL) and 10ul of transfection reagent were mixed at room temperature for 15 min, and then added into a 6-well plate containing 1ml of normal DMEM. After 24 h, the culture medium was removed and fresh DMEM medium was added to continue culture.

文章轉染BMDM細胞方法總結
我們使用轉染試劑（＃AD600150，ZETA life，USA）將ABC A9的特定siRNA轉染到細胞中，根據制造商的規程使其表達沉默.簡而言之，將BMDM巨噬細胞放在6孔板中，密度為2.5×105細胞。 當細胞密度為70％時，進行轉染。 在室溫下混合10 µL siRNA（100 pmol/mL）和10 ul轉染試劑并靜止15分鐘，然后加入含有1ml正常DMEM的6孔板中。24小時后，除去培養基并添加新鮮的DMEM培養基以繼續培養24小時后收細胞。

引用產品

AD600150，Advanced DNA RNA transfection reagent（Advanced DNA RNA轉染試劑）；
熱門產品
AV500150，小動物活體轉染試劑Advanced DNA RNA；
P400150，Sirius DNA轉染試劑；
Z7181FBS-500,胎牛血清（烏拉圭血源）；
Z7010FBS-500,胎牛血清（澳洲血源）；
BM0001-100，雙抗;
BM0002-100，0.25%胰酶;
ZETA life轉染試劑簡介：
  2018年ZETA life公司與美國加利福尼亞大學舊金山校區聯合開發用于哺乳動物細胞、活體動物轉染的Advanced DNA RNA第三代多肽小分子轉染試劑，此技術成為新的全球蛋白功能、免疫細胞及干細胞研發及生產的主要關鍵技術之一。ZETA life，Advanced DNA RNA轉染試劑優勢：

1.第三代多肽小分子轉染試劑進入細胞后可幾小時內快速被代謝對細胞不毒素影響;
2.可轉染極度難轉染的免疫細胞，懸浮細胞，原代細胞、干細胞等；
3.使用ZETA life轉染試劑已發表文章的轉染細胞名稱：
THP-1、RAW264.7、小鼠小膠質細胞BV-2、小鼠腦神經瘤細胞（N2A)、懸浮淋巴白血病細胞K562；

原代骨髓巨噬細胞(BMDM)、脂肪間充質干細胞(ADMSCs)、造血干/祖細胞(HSCs/HPCs)、原代精原干細胞(SSCs)、原代大鼠肝細胞（Hepatocytes ）、原代子宮內膜上皮細胞(BEECs)、原代牛乳腺上皮細胞 (BMECs)、原代雞胚肝細胞（CEHs）；NIH-3T3、人正常肝細胞 LO2、豬腎細胞PK-15、人舌鱗癌細胞SCC-25，CAL27；結腸癌細胞（HCT-116 SW480 HT-29）等。